甲基赤藓糖醇d激酶4二磷酸胞苷2C第四关键酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol激酶，CMK）为萜途径植物生物合成途径磷酸4-甲基赤藓糖醇（methylerythritol4phosphate路径DXP / MEP）。据这项研究樟脑转录组数据，利用RT-PCR（反transcriptionPCR）克隆从药用植物如樟树得到4-二磷酸胞苷基因2C-甲基d赤藓糖醇激酶，其序列的命名CcCMK1（GenBank登录号Ku376098）生物信息学分析表明，该开放框架基因阅读框1212 bp的编码403个氨基酸的（ORF），推测4446 kDa的，等电点的分子量（理论的pH）的跨膜结构499的分析结果表明，有一个在跨膜蛋白CMK没有结构。
号肽的分析表明，这是一个非分泌的蛋白质和没有信号肽存在。细胞定位表明它位于叶绿体中。过实时PCR检测使用荧光樟脑冰片，樟脑油，芳樟醇，樟脑和五种类型的化学型樟脑基因CcCMK1异源表达的，结果表明，该基因在油CcCMK1最高表达樟脑，在表达水平最低樟脑冰片提供了关键酶桉树的生物合成途径的萃取研究基地。脑，4-二磷酸胞苷2C-甲基d赤藓糖醇激酶（CMK）;克隆;生物信息学分析，表达分析[摘要] 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol激酶是萜类甲基磷酸途径的赤藓植物生物合成途径（MEP）樟树转录数据的研究的第四关键酶我们刘宝使用RTPCR和命名CcCMK1基因4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol激酶，然后沉积于GenBank（登录号：Ku376098）生物信息学分析揭示了开放阅读框（ORF）的1212被CcCMK1 bpThe推定蛋白质编码403氨基酸和其分子量为4446 kDa的和等电点为理论上分析499Transmembrane结构表明，有信号肽的无跨膜结构分析表明，它是一个非分泌蛋白，也没有信号劳动力的亚细胞定位表明，叶绿体是位于CMCC K1基因在使用实时樟树五个化学型的chloroplasteAnalyse表达PCR显示其表达水平最高Ç樟，并且最低的搜索冰片camphorThis提供碱来表征的生物合成途径萜类ç香樟[关键词]樟树的关键酶的基因; 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol激酶（CMK），基因克隆，的生物信息数据; analysisdoi短语：10.4268 / cjcmm樟脑樟树（L）Presl的不仅是常见的药用植物，含有精油或天然经济植物。根，樟树，叶子和果实的皮可以感冒药，诊断和治疗可有头痛，风湿病，脾胃脘腹冷痛等疾病。枝和桉树叶可提取樟脑和蚝油，并在医药和香料有很大的经济价值。用活性成分是挥发油，如冰片，樟脑，芳樟醇，烯基芥水，榄香等，樟脑化学成分的性质和化学樟脑型和挥发油的化学组成的含量之间已经樟脑很多报道[13]。年来，随着新一代测序技术的广泛应用，人们正在研究樟脑基因组，转录组角。脑江翔梅等以叶片5种化学类型的作为材料，转录组分析[4]，共955的UniGene注释55，其中一个单一的棒424的参与的UniGene，二萜，倍半萜和萜烯骨架合成。和工作体229的UniGene注释114比较由诱导的转录蔗糖樟脑基体细胞胚，发现897个基因可以以体细胞胚的发生参与[5]。前，从桉树中克隆的基因并不多。鹏Li及其同事用于克隆肌动蛋白基因香椿[6]同源克隆方法。压等的尺寸也已经在EFLA基因片段通过同源克隆方法克隆[7]。和同事克隆C. tenuipilum基因CtGers香叶醇合酶和检查操作。8]大多数挥发性油萜类化合物的主要成分，在植物中萜类化合物的由两个独立的路线，分别设在甲羟戊酸途径（细胞质甲羟戊酸途径，MVA）[9]，位于木材质合成脱氧的方式ketoose 5磷酸盐（DXP）途径或甲基赤4phosphate（MEP）[10]。CMK，即，4-二磷酸胞苷2C-甲基d赤藓糖醇激酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritolkinase），MEP途径是必需的4酶的酶反应中，MEP萜类化合物的合成途径仅一种激酶可以是4-二磷酸胞苷2C-甲基赤藓糖醇（4diphosphocytidyl2Cmethylerythritol，CDPME）作为底物4-二磷酸胞苷2C-甲基d赤藓糖醇2-磷酸（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol2phosphate，CDP_ME2P），经过一系列的反应，以产生共同途径异戊烯二磷酸的两个中间独立（异戊烯基二磷酸，IPP），[11] IPP双键的部分转化异戊烯基二磷酸异构酶（异戊烯基二磷酸异构酶，IDI），以二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP），这两者都是前体的作用下异构体萜类化合物。前，一种药用植物丹参[12]杜仲[13]，雷公藤[14]基因与CMK成功地克隆，但它尚未被克隆的通道基因MEP的生物合成萜类化合物樟脑。于此数据库的基因序列上CMK转录樟脑，同时使用的方法，从在通过RT-PCR技术和生物信息学分析，乙酸芳樟中的cDNA基因CcCMK1叶子成功地扩增定量实时，异樟脑油五种类型樟脑，樟脑，在CcCMK1冰片樟脑化学型的基因表达，对樟脑挥发油生物合成途径生物分析的有效组合物提供参考。
脑植物材料（樟脑冰片，樟脑，芳樟醇，樟脑油，樟脑ISO）从樟树江西养殖基地收集（欧阳少林教授好听），置于温室的中国传统医学研究所的中国发展研究院。器（ABI公司），TF 7500实时PCR型系统（ABI公司）5810R低温冷冻离心机仪（Eppendorf公司制），凝胶混合物工厂MM400的实时定量PCR仪（ Retsch公司公司）分光光度计NanoDrop2000（Thermo Scientific）进行，成像分析仪UV凝胶（基因有限公司）。RNA提取试剂盒购自北京华洋生物科技有限公司;寡（dT）18.10mmol·L-1的dNTP，5×反应缓冲液，的RiboLock RNA酶抑制剂，反转录酶的RevertAid从赛默飞世尔科技（中国），DL 2000标记DNA，实施例的Taq，SYBR预混防爆TaqTM购买从Takara公司购买; T4 DNA连接酶，质粒pGEMT easy载体购自Promega生物科技有限公司购得。用RNA浓度分光光度计提取从总RNA使用根据叶的总RNA的指令的中国外来核酸提取试剂盒的方法中，提取和cDNA的制备和NanoDrop2000质量检测，完整RNA性别的1％琼脂糖凝胶电泳。RT-PCR使用该方法，逆转录根据合成的cDNA CcCMK1的体积以下进行：1个微克RNA，寡（dT）18 1微升，双蒸水加至12微升，加热65℃5分钟，在冰上冷却，并放置在产品上，该产品在添加5×4英尺反应缓冲液后冷却，10mmol·L-1的dNTP 2微升，的RiboLock RNA酶抑制剂1微升，
香樟树的RevertAid逆转录1微升，混合中，加热1个小时42℃，加热5分钟70℃，将产物置于冰上冷却，单链cDNA，储存在-20℃下用于克隆基因和分析表达。据CMK1阅读框基因CcCMK1开放引物的全长cDNA的克隆（ORF）被设计，CMKL：5CAACATGGCTGCCACCCAATTCC3“; CMKR：5GACATTACTTAAATGGACAAGCGGTC3。用LA Taq 05微升，10×使用LA TaqBufferⅡ5微升，25mmol·L-1的dNTPs 4 UL，1微升的cDNA，08微升引物L，引物R 08微升，添加50 ddH 2 O中：PCR反应按照下述体积进行UL中，反应条件如下：94℃变性5分钟，随后进行30个循环：94℃30秒，50秒，30℃72℃1分钟30秒，延伸10分钟72℃循环后，13℃温育后，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳，选择约1200个碱基对的PCR产物条带，与根据下列体积pGEMT中easy载体连接：缓冲T4 DNA连接酶快速连接2× 5 PI，pGEMT中easy载体微升1，PCR产物2微升，1个PL T4 DNA连接酶，双蒸水加至10微升，在反应条件为：22孵育℃10分钟。接到热激发后产生转化到大肠杆菌DH5α中，选择氨苄青霉素抗性，用引物M13阳性克隆已被选定为上海吉美生物医学科技有限公司菌落PCR，北京分公司排序。用NCBI的ORF搜索CcCMK1最大开放框架基因读取（ORF）生物信息学分析CcCMK1分析使用InterProScan的（HTTP：// wwwebiacuk / INTERPRO /）蛋白质的物理化学性质的分析[15]使用TMHMM V20服务器（HTTP：// wwwcbsdtudk /服务/ TMHMM /）预测的跨膜[16];使用SIGNALP 41服务器（HTTP：//信号肽分析wwwcbsdtudk /服务/ SIGNALP /）[15]; TargetP11使用（HTTP：// wwwcbsdtudk /服务/ TargetP /）的亚细胞定位，使用SWISSMODEL（HTTP：// swissmodelexpasyorg /）的域的三维建模[15];使用多重序列比对和二级结构的分析DNAMAN进行，使用MEGA 6的系统发生树的结构进行的，自举重复1000次。CMK1使用中国外来核酸提取试剂盒不同化学型，以下的说明的基因的表达分析提取不同化学型叶片的RNA，用RT-PCR方法被樟脑获得的cDNA不同类型的化学品。时PCR引物从对于在基因CMK1实时PCR检测设备用于通过ABI TF 7500 PCR类型的实时系统中的不同化学类型的樟脑的表达设计中，反应体系是如下：1的cDNA微升，SYBR预混实施例的Taq 5微升，PrimerL 02微升，PrimerR 02微升，ROX（ⅱ）02微升，34微升ddH 2 O中，PCR反应条件为：95℃30秒，95秒，5 ℃60℃34 s。个生物学重复每个样品进行，并且使用下式2-ΔΔCT进行分析的数据。
于cDNA克隆的全长序列的结果基因转录数据库CcCMK1 CMK1，下游引物设计上将cDNA扩增开放阅读框，琼脂糖凝胶电泳以1％，见。1表示在大约1212 bp的产生光，为单一条带，用相同的一组转录的基因文库大小CMK1，将PCR产物与质粒pGEMT easy载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中冲击法的基因的热，氨苄青霉素阳性克隆阳性筛选，图2。生约1400碱基对的单亮带，选择阳性菌落，使用质粒pGEMT easy载体通用引物SP6和T7测序，测序涉及在NCBI网站上的稻瘟病对准，显示CMK家族基因序列显示使用InterProScan的CcCMK1基因CcCMK1的克隆成功CcCMK1生物信息学分析的物理化学性质（HTTP：// wwwebiacuk / INTERPRO /）的CcCMK1蛋白质的物理和化学性质进行了分析，推测具有式C4886H8193N1581O2064S324，分子量4283 4446 kDa的，等电点（理论等电点）499，该蛋白质不稳定（不稳定性指数）的系数，表明脂肪的稳定系数（脂族指数）2758，亲水性系数使用TMHMM V20服务器0710.（平均亲水性的，肉汁）（HTTP：// WWW CBS DTU DK /服务/ TMHMM / ...）的结果S的位于膜，跨膜缺失外的跨膜预测显示。用41 SIGNALP服务器（HTTP：// wwwcbsdtudk /服务/ SIGNALP /）的信号肽的分析表明，非分泌的蛋白，信号肽是没有的。用TargetP11（HTTP：// wwwcbsdtudk /服务/ TargetP /）的亚细胞定位表明定位于叶绿体中，根据[1718]与其它定位MEP途径蛋白的结果。化CcCMK1蛋白多重序列比对，并用所选择的蛋白的CcCMK1更密切的关系的四个蛋白质序列构建，使用用于多重序列比对DNAMAN系统树，如图3 CcCMK1蛋白示出同源性的结果其它物种的蛋白质CMK为7775％，并含有氨基酸的高度保守HGPD激酶家族的序列。PXXXGL（G / S）SS（A / G）XX1225（K / R）（在所示图3黑线），该家族还包括半乳糖激酶，高丝氨酸激酶，甲羟戊酸磷酸激酶，甲羟戊酸激酶和[19 ]。级结构和包含1212 bp，编码的预测的403个氨基酸的最大蛋白基因的三级结构预测CcCMK1 CcCMK1开放阅读框。用蛋白DNAMAN的二级结构分析，α螺旋的蛋白的二级结构占67％，33％β折叠，其代表159％的无规卷曲。功能和结构密切相关的蛋白质，使用建模域SWISSMODEL三维大肠杆菌二磷酸胞苷2C-甲基-4- d赤藓糖醇在三斜晶系结晶形式（2ww41）激酶为模板，其序列相似性该盖033是066和93至388个氨基酸（参见图3）。究InterProScan的蛋白质结构域，其结果被示出为具有PSI（CMK）和功能性激酶结构域属于HGPD家族与前述序列的多重比对兼容。自结核分枝杆菌衍生的PSI，是MEP途径的酶为病原菌这样的酶的存活是必需的。
可能是一个的情况下的ATP存在下，催化4diphosphocytidyl2Cmethylderythritol（CDPME）产生4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol 2phosphate（CDPME2P）[20]。同一时间的基因表达CcCMK1化学型的不同型号，不同化学型的收集离开相同条件下生长，重100毫克，使用中国外来核酸提取试剂盒提取步骤芳樟根据该指令，异樟脑，樟脑油，使用该RNA的分光光度计NanoDrop2000内容樟脑和RNA冰片樟脑片材，使用该方法的cDNA的使用1μg的不同类型的化学品樟脑的RNA的获得的RT-PCR产物，20倍稀释的cDNA，-20℃下储存使用。用DNAMAN设计和肌动蛋白的定量实时引物的cDNA，在图6中CcCMK1基因具有在油性痰最高表达示出定量实时荧光检测结果樟脑CcCMK1和脑瘫最弱的表现。树是樟脑讨论樟科植物樟樟科植物肉桂是一种传统的药用植物，具有药用成分悠久的历史，它的主角药物挥发油萜烯，祛风散寒，理气的活力，疼痛瘙痒，强心脏和杀虫剂等杀虫作用。桂种植物具有的现象明显的化学变化，即，由于不同类型的化学品的分化的化学组成不同，樟脑分为芳樟醇（组分芳樟醇主），樟脑（主成分樟脑），樟脑油（桉树脑主成分），冰片樟脑（冰片的主要成分）和异樟脑（异橙花叔醇主组分）和另一种类型的化学的。21] Liu和挥发性组分的多变量分析的不同化学型的其他分，结果从由GC静态顶部空间（SHSGCMS）质谱测量不同表明，25个样品被确定从171种化合物[1]，其中β-芳樟醇，莰烯，β-]愈创木烯，萜品烯γ，α-崖柏烯，2-乙基呋喃，和大的α牛烯可以检测所有样品中的石竹烯8化合物。在各类重大分歧和五个水化学类型的桉树叶的挥发性成分的水平。成分分析的12个元件表明测试愈创木烯]呋喃-2-乙基，7个挥发性组分α石竹烯，香叶烯基大，δcubebene醛，己醛和链烯基是五种类型的棒的决策变量的对化学桉树的分类很重要。着功能基因组学技术的发展和完善，迫切需要揭示导致从基因组学的角度来看，樟脑五种测序的物种和其他问题中的化学类型樟差异的分子机制使用Illumina测序技术，共156整体278的UniGene的，584碱基对的平均序列长度，总注释的UniGene的3580％，则基因注释基因的代谢物的1019％的化学式转录滑动次级生物合成途径，单萜的参与，二萜，倍半萜烯和萜烯，类骨架的合成[5]。目前为止，它已经从全长基因6香樟，只有属于家庭成员，即，杨涛合酶基因的克隆一个克隆的基因香叶醇合酶张的头发[8]。4-二磷酸胞苷2C-甲基d赤藓糖醇激酶萜MEP途径CMK是通过第四步骤的常见的合成途径酶的质体催化的反应是唯一激酶MEP途径的基因，报告CMK减。隆在编码大小约31 kDa的包含233个氨基酸的多肽，属于激酶的家族HGPD保持[22]所述家庭PSI CMK的大肠杆菌。ATP存在4-二磷酸胞苷2C-甲基赤藓糖醇埃希氏激酶活性的重组PSI，催化4-二磷酸胞苷2C-甲基-D-赤藓醇4产生2-C-甲基d赤藓糖醇磷酸二磷酸胞苷2 [22]。是克隆至樟脑4-二磷酸胞苷2C-甲基d赤藓糖醇CMK激酶基因（CcCMK1）和基因CcCMK1家族的一个综合生物信息学分析和功能结构域CMK PSI，和CMK基因cDNA第一其他物种具有高度同源性。不同化学型CMK1基因表达量进行分析，基因表达樟CcCMK1江翔合成的最高表达分析梅单萜等新代谢途径可编码芳樟醇合酶的结果个Unigenes显示结果表明，在合成酶基因芳樟醇表达高水平的化学类型芳樟醇的但在类型的化学品油樟较低水平[7]。此，萜烯的不同化学类型合成樟脑的不同阶段的酶含量可能会有所不同，需要进行进一步的研究来发现差异的本质。这项研究中，仅提供了克隆分析基本的分析元件和药用植物樟脑基因CcCMK1萜生物合成途径基因的表达。
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