根据这项研究，测序数据转录樟脑，特异性引物设计用于扩增通过使用RT-PCR的开放阅读框的，合成的甲羟戊酸激酶克隆樟脑（甲羟戊酸激酶，MK）逆转录ORF序列的完整长度。源重组方法Gibison克隆到上pSMART-LCKan目的向量进行测序，以鉴定重组质粒阳性分析和生物信息学。序结果表明，该基因的ORF CcMK基因具有1194 bp的长度和编码397个氨基酸。物理和化学分析表明，式CcMK C1 852H3 027N487O574S17，的845.34相对分子质量为41，等电5.30的点的蛋白。CcMK是在无信号肽稳定剂的亲水性蛋白质定位于细胞质的蛋白质，并且含有N端和C端保守HGPD特异性激酶家族域。子系统发育分析表明，该蛋白CcMK樟脑安祖花和植物蛋白，川贝母，野生香蕉，海枣，油棕等。
同一个分支中，关系更密切。CcMK检测叶的基因表达，茎和根实时PCR由樟脑，结果表明，在樟树叶最丰富的基因的表达CcMK。是CcMK基因和生物信息学分析樟脑的第一个克隆的基因在萜樟CcMK的合成途径中的作用的进一步研究奠定了理论基础。
键词樟脑;甲羟戊酸激酶;克隆;基于樟树的转录的数据图生物信息学分析Q946.5文献AAbstract码字，特异性引物，通过反转录RT-PCR设计成从克隆甲羟戊酸激酶（MK）的全长ORF序列C. camphora（Cc）。据基因CcMK Gibison基因的同源重组的方法克隆到载体pSMART-LCKan。抗性和DNA测序鉴定重组质粒。CcMK进行了生物计算机分析。
序结果显示，该基因CcMK ORF为1194 bp的，编码397个氨基酸。物信息学分析表明，该蛋白质的分子式为CcMK C1 852H3 027N487O574S17，相对分子质量为41 845.34和等电点为5.30。CcMK蛋白在细胞质中稳定的蛋白质无信号肽，其含有N-末端特异性家族激酶HGPD和终端C的分子系统树的分析的保守结构域的局部显示，蛋白质和CcMK花烛amnicola，川贝母，芭蕉亚芏，海枣，油棕MK蛋白在的密切关系在同一分支。CcMK基因从樟树最初克隆并用生物信息学分析这些结果奠定对基因在CcMK萜合成字C. camphora.Key樟树的作用的进一步研究的基础;.羟基酸激酶;基因克隆，生物信息10.3969 / J。issn.1000-2561.2017.12.017樟脑[樟树（L.）Presl的]属于樟科，它是一种常见的常绿阔叶树。树资源在中国很丰富，主要分布在长江流域及南方各省盆地（区）。1]它在绿化环境的重要作用，并在最近几年[2]被广泛用于园林绿化。脑富含挥发油，挥发油是最萜，芳香气味和各种广泛应用于生物活性食品，化妆品和药物产品[3-4]。类化合物显著的商业价值和药用价值，如单萜是香料的重要芳樟醇气味作为化妆品原料[5]，倍半萜烯化合物是医疗抗疟药青蒿素[6]中，二萜类化合物的紫杉醇是一种重要的抗癌药[7]等等。羟戊酸途径（MVA）是植物来源的类固醇生物合成的主要途径之一。
8]甲羟戊酸激酶（MK）是一种代谢途径整个MVA途径控制的速率限制酶，依赖ATP的三个第一酶连续酶。
植物中，所述酶MK主要参与类异戊二烯衍生物和代谢物，类固醇的合成，是芳族化合物在柠檬油的主要来源[9]。MK的功能，以使在磷酸腺苷转移磷的成甲羟戊酸-5-羟基位置上的甲羟戊酸-5-磷酸[10]的形成中，经过一系列的酶反应，以产生IPP的前体的合成萜类化合物。前，MK基因在许多植物中，如青天葵[11]杜仲[12]三七[13]中，野生型烟草[14]茯苓[15]和豆瓣被发现。16]对现有报告的基础上，本文采用香椿转录组数据来获得高度同源基因MK序列。过设计特异性引物，首先从在根部施加到MK基因的表达的cDNA序列樟脑基因CcMK克隆，茎，叶和分析生物信息学分析，该基因用于进一步研究CcMK萜樟脑的生物合成途径的化合物的作用是基础。料与方法材料与广西科学院育苗林基地，移植到国际实验室竹藤温室培养收集试剂苗樟树。集嫩叶和迅速在液氮中冷冻并储存在-80℃下的RNA提取试剂盒购满型金生物技术有限公司，小量制备试剂盒质粒试剂萃取攻丝买爱有机式科技有限公司，反转录试剂盒全型的第一链cDNA合成试剂盒来自Thermo生物社会被购买时，pSMART-LCKan矢量和感受态细胞DH5α中在北京购博鳌瑞斯生物科技有限公司基于使用NEBbuilder在线软件，建立一个对特异基因扩增PCR引物CcMK转录组分析数据引物设计方法：CcMK-F; 5-atatca -3。向扩增pSMART-LCKan线性化的质粒，pSMART-F在HincII位点; 5-GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATAC-3“和pSMART-R; AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG 5-3”，反向扩增在HincII位点pSMART - 该质粒线性化LCKan引物序列由上海生工生物有限公司合成总RNA从樟脑萃取，所有类型的金提取试剂盒cDNA合成和纯化樟脑Transzol叶的总RNA的植物，使用纳米滴2000检测浓度和完整性总RNA。过将cDNA反转录合成是根据cDNA合成试剂盒马克西第一链的说明书进行。脑CcMK基因通过RT-PCR RT-PCR扩增，将反应体系的总体积为50微升，含KAPA HIFI Taq酶25 PL，PL 2的cDNA，引物各2微升的上游和下游引物，19 ul ddH2O。性在95℃的PCR扩增过程的C 3分钟; 95℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸90秒，循环30次，72℃延伸10分钟，置于4℃后。应后，通过琼脂糖凝胶电泳在1％检测到的PCR扩增产物。
PCR产物的PCR产物基因的CcMK克隆和测序纯化和回收，靶基因片段用CcMK pSMART-LCKan片段线性载体回收并连接产物转化到连接大肠杆菌DH5α感受态细胞，该板的卡那霉素抗性筛选进步，被选择用于菌落PCR分析单菌落，37℃培养过夜阳性细菌鉴定，提取质粒中美生物学会对太和进行了测序。析樟脑CcMK NCBI序列分析应用在线计划基因的Blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和所编码的蛋白质的CcMK樟脑同源序列的比较氨基酸水平; 7.0应用的DNAMAN软件执行几个序列的比对分析的蛋白质CcMK睾吸虫和其同源序列的序列。用MEGA 6.0软件，CcMK睾吸虫和其他植物蛋白MK的分子系统树是由NJ的方法构建。用的protParam软件（http://cn.expasy.org/tools/protparam.html）所述的蛋白质CcMK樟脑预测CcMK分子量比率分析，等电点等，使用TMHMM2的物理性质0.0（HTTP：// WWW .cbs.dtu.dk /服务/ TMHMM /）如跨膜蛋白CcMK区的分析，使用P1.1目标（http://www.cbs。dtu.dk/services/TargetP/服务器）CcMK位置的亚细胞蛋白质的在线分析;使用SignalP软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）进行分析的CcMK蛋白的信号肽。白质结构域的分析的Prosite（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）SMART工具和工具的基础上分析樟脑CcMK CcMK蛋白结构域; CDD应用程序数据库（HTTP：//www.ncbi.nlm.nih GOV /结构/ CDD / wrpsb.cgi）找到CcMK蛋白质的区域。用二级结构SOPMA的分析的方法中的蛋白质CcMK蛋白质序列CcMK樟脑樟脑的3D结构的预测（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page = npsa_sopma.html）的蛋白质的三级结构的预测还使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）中进行。CcMK基因检测在实时PCR在不同组织中的不同组织部位（实时PCR）CcMK基因表达，使用实时基因表达樟脑CcMK叶PCR过程，茎，用于检测根检测系统的实时PCR Bio-Rad公司CFX96。用的引物的序列为：CcMK-F：5-TGAGCGAGCATCCAGGCATC-3“; CcMK-R：5-TGAAGCAGGCGACTGGATAATG-3”。于PCR实时检测反应系统到系统的iQ SYBR Green超（BIO-RAD），每个反应体系中引用重复3次。
PCR程序如下：95℃变性3分钟，95℃变性10秒，58℃退火15秒，72℃延伸20秒，45个循环的解离步骤。时反应樟脑肌动蛋白基因的PCR CcACT（KM086739.1）作为内对照，内部控制引物的序列：ACTIN1-F：5-GAGCTACCTGATGGGCAAGTG-3“; ACTIN1-R：5-AGAACCACCACTAAGCACGATG-3”。过叶中的表达量测量组织表达。果和分析cDNA克隆CcMK通过使用cDNA的PCR扩增为电泳的柠檬matrice.Les结果在图1中目标频带被示出是符合预期大小克隆到所述pSMART-LCKan矢量阳性克隆后，选择和发送到公司上海生物测序，1194个碱基的大小，编码397个氨基酸（图2）。氨基酸序列CcMK CcMK由该基因用于BLASTP搜索编码的氨基酸序列的分析，分析结果表明，具有在氨基酸同源性高的各种蛋白质MK的植物其中，麻疯树（麻风树）JcMK（XP_012089078。），莲花（莲）NnMK（XP_010278085.1），杏仁（桃）PpMK（XP_007205329.1），梨（梨X白梨）PBMK（ XP_009349394.1），苹果（苹果属家蝇）MDMK（CcMK同源植物XP_008388579.1），枣（枣树）ZjMK（XP_015875214.1）川桑（桑notabilis）MnMK（xp_），李子（梅花） PMMK（XP_008246488.1）76％至73％。述植物的多个序列的比较分析进行了使用DNA Man7.0（图3）。过比较，进化关系CcMK MK蛋白质和其他植物蛋白，
香樟树来自其它41种的系统树中选择的41的氨基酸序列构成NJ（图4）。果表明，该蛋白樟脑CcMK红掌（红掌amnicola）AAMK（JAT64358.1）川贝（川贝母）FcMK（APU50924.1），野芭蕉（芭蕉亚种。）MaMK（XP_009414472.1）海枣（海枣）PDMK（XP_008790991.1），棕榈油（油棕）EgMK（XP_010906879.1的）和MK其他植物蛋白在同一分支上，更密切的关系。CcMK预测使用在线工具EXPASY预测分析蛋白质组服务器的物理和化学性质所编码的蛋白质的protParam CcMK分析理化性质的蛋白质。C1 852H3 027N487O574S17，41个的相对分子质量845.34，等电点5.30，带正电荷的残基（精氨酸 赖氨酸）31，带负电荷的残基（天冬氨酸 GLU）40.指数的估计的蛋白CcMK脂肪颗粒是107.88和不稳定的系数是35.10，这是一种稳定的蛋白质。CcMK SOSUI由线分析，结果表明，不含信号肽，平均0290 428的氨基酸疏水性的，疏水性和亲水分布的CcMK蛋白，所述的跨膜结构域预测结果结合，蛋白可溶性是CcMK描述的蛋白质。过SMART分析工具蛋白结构域的CcMK分析，CcMK蛋白包含两个保守结构域，即HGPD N-末端激酶的特定区域的家庭和保守的C-末端激酶结构域HGPD。氨基酸序列的位置132-213是激酶HGPD的N-末端区域。置285-365是HGPD激酶的C-末端的结构域。基酸之间CcMK预测编码通过BLASTP甲羟戊酸激酶蛋白1-383的功能结构域（图5），这表明它的甲羟戊酸激酶的功能。膜和由SIGNALP 4.1服务器，无信号肽的蛋白质CcMK，非分泌的蛋白（图6）预测的细胞内定位的信号肽CcMK蛋白质分析。用的在线软件的亚细胞定位的预测P1.1目标服务器表明，该氨基酸序列的概率包括叶绿体转运肽是0.016，线粒体转运肽的含有0.128可能性，0.279含信号肽，其他的可能性，以0.541用的4可靠性的指标，表明CcMK可以在细胞质中被局部化的可能性。CcMK TMHMM预测蛋白使用链跨膜结构域FOSS多肽在整个外细胞膜，据推测，根据该物质的蛋白质不输送CcMK蛋白质合成直接参与催化细胞基质。然从预测结构CcMK两种蛋白质，该蛋白质螺旋α-的二级结构，不规则卷曲蛋白CcMK的链的β-扩展的元素，上述元素的的二级结构，和角度的预测的46.85％，26.20％，7.30％，19.65％的比例。视蛋白的整体结构的A-螺旋蛋白CcMK伤口的点（图7）和不规则是比较小的角度的β-链延伸的主要结构部件和是分散在整个和多个多肽链中。此，CcMK蛋白是复合结构。自动模式下，同源性建模，瑞士模式线的CcMK蛋白质三级结构预测结构模型CcMK猜到三种蛋白质（图8），则CcMK智人蛋白（蛋白质2r3v.1.A作为模型通过CcMK自ExPASy结构评价程序推导的蛋白质序列的相似性已达到42.8％。建模7-328个氨基酸，该模型的盖率为90％和GMQE模型蛋白为0.69。因表达CcMK通过基因表达的实时PCR检测特异性组织CcMK分析，在根部检测的基因的表达，樟脑茎，叶。果表明，该基因在叶子中表达最高，其次是茎和根中的弱表达（图9）。
讨基于香椿的转录的序列数据，该E研究成功克隆通过RT-PCR基因MK香椿。基因的开放阅读框有1194 bp的长度和总的397个氨基酸编码。序列同源性分析表明，CcMK是高度同源的氨基酸各种植物的MK蛋白。
果表明，该分子系统树构建，樟脑MK亲属植物红掌，贝母，野芭蕉马来西亚，日期等。附近。CcMK一个亚细胞定位是细胞质，跨膜没有亲水性的，无信号肽和包含稳定蛋白激酶家族HGPD保留两个功能域。时定量PCR表明，该基因CcMK表达香椿叶最高。于对甲羟戊酸激酶的结果樟脑的分析，基因的抗体制备和结算提供理论指导，萜类樟脑调控的基本生物合成途径的进一步应用CcMK。羟戊酸途径中的植物（甲羟戊酸途径，MVA）是萜烯的合成，甲羟戊酸激酶的一个重要手段，其中，所述甲羟戊酸途径为位于细胞质酶的关键酶，通过调节到反馈抑制代谢产物[17]。植物中的甲羟戊酸途径可产生具有期望合成IPP和萜类化合物的其它前体，所以基因表达的CcMK量可以直接或间接影响萜类化合物[18]的内容。Lluch等人[19]具有甲羟戊酸激酶基因拟南芥的研究基因的表达，结果表明，根，茎，叶和其它组织可以检测到甲羟戊酸激酶基因片段，但在量表示根和花序最高。林乡Huang等[11]表明，甲羟戊酸激酶在黄连的灯泡的最高表达。这项研究中，实时PCR分析显示，樟树叶，萜烯的主片合成樟脑假定网站CcMK最高的表达。
CcMK蛋白具有重要的研究价值如樟脑合成酶键。类化合物是植物的最大次级代谢产物，并且具有在植物中显著生理和治疗性质。20]合成生物学和基于分子生物学代谢工程已经成为最流行的方式，以提高在植物中生产萜类化合物近年来之一。因克隆CcMK这里和分析信息，并提供的萜樟植物育种和其他合成的调控奠定了基础。
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