角鲨烯环氧（SE）是三萜类化合物中最中国草药和药用的细菌，这可能会影响三萜类化合物的积累的合成途径限速酶的速率。建了角鲨烯环氧酶（se）基因的原核表达载体，优化了其重组蛋白的表达条件。用O-cDNA扩增Sechin。草作为模板，并克隆到pMD18-T载体纯化，然后将阳性克隆进行筛选，并连接到原核表达载体pET28a后，构建重组质粒pET28a中-SE，之后，已转化为E卷曲酶消化。受态细胞BL21（DE3）中诱导表达和正交试验L9（34）[JP2]用于优化表达的条件和靶蛋白的纯化。果表明，在不同的正交治疗之间的蛋白质表达差异显著（P <005）。主要诱发因素是浓度时间>温度> IPTG和诱导时间具有最效果显着地表达重组蛋白（P <005）。有观察到对重组蛋白的表达的浓度和IPTG的温度的效果不显著（P> 005）和SE重组蛋白的诱导作用，当浓度最终IPTG是02毫摩尔/ L时，诱导时间为下午7点和感应温度为26℃。好樟芝;角鲨烯环氧酶;原核表达;正交设计中图分类号：S5673 901文号：货号：1002年至1302年（2017）16-0050-04收稿日期：2016年4月10日基金项目：科研基金的发展福建农林大学（KF No.）; 2011年福建省计划（编号K80ND8002）。
者简介：李静（1985-），女，湖北武汉，博士，助理研究员，主要从事研究食用菌。子邮件：@ 163com。讯作者：林曦会计，研究员技术JUNCAO主要从事推广。子邮件：lzxjuncao @ 163com。萜类化合物是表明，三萜类化合物有保肝作用，抗炎，抗过敏，抗肿瘤，因此提供了优势，在大多数食用菌和药用植物和médicinaux.Des研究中最重要的有效成分之一显着的经济效益。鲨烯环氧（SE）是在合成途径三萜类化合物的一个重要的调节酶，位于内质网的微粒体和催化角鲨烯的合成从角鲨烯（SQ）2，3-氧化。（2，3- oxydosqualene），也能合成三萜类化合物，甾醇，胆固醇和其他重要的萜类化合物[2-3]。此同时，还催化在双C-C键的氧原子的插入在环氧树脂反应P450，以形成一个大的结构[4]。前，基因鲨烯环氧（如果）克隆人类，动物，植物和真菌和王森和他的同事已经表明，之间存在正相关关系mRNA的表达和三萜类化合物的产生[5]。an等人在人参根克隆后，抑制了三萜类化合物的通过RNAi技术的表达，SE一直被认为是在速率三萜类化合物的生物合成限速酶;人参SE蛋白的表达证实了其相关的人参皂苷含量。樟芝，樟芝，牛蒡蘑菇和棉蚜的名义下也是已知的，是在20世纪90年代在台湾发现了一个传统药用细菌和通常在中空烂牛蒡生长。8]这是非常缓慢的，但三萜类化合物的含量是高的，并具有对肿瘤的有效治疗作用，降血脂和降血糖，并且是深受消费者喜爱。9]在樟芝角鲨烯2.3氧化产物通过SE是用于合成的羊毛甾醇，形成胆甾醇，三萜类化合物和其它化合物的重要底物，并起着作为酶限制了速率中起重要作用反应[10]。肠杆菌（E卷曲）BL21（DE3）是一种通常用于异源蛋白的有效表达的一种原核表达菌株，并且具有的表达效率高的优点，但表达效率外源蛋白受培养时间，培养温度和诱导剂的影响。因素的影响是相当不同的[11]，以获得最佳条件在SE樟芝的蛋白质的表达，所述的pET28a-重组质粒导入E卷曲BL21（DE3）用异丙基β-d-thiomilk。（IPTG），诱导时间和感应温度进行了筛选，诱导条件由正交试验优化，以及用于樟芝原核表达的最佳条件，从而奠定了进一步研究SE蛋白活性和三萜类化合物合成机制的基础知识。料与方法材料与试剂的AC001株樟子松农杆菌（GenBank登录号：KM925002）由台湾神农真菌生物科技有限公司给出并留在国家真菌工程技术中心。供。×Taq酶预混，大肠杆菌DH5a中，香樟大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞从天根生化科技（北京）有限公司购买的; His60 Ni Superflow树脂，pMDTM18-T购自TaKaRa;多种标记D2000，直接装载色标记N，N，N”，N-四甲基乙二胺（TEMED）从Genestar购买; TRIzol试剂购自Invitrogen;逆转录试剂盒购自TOYOBO; AMPIC（AMP），卡那霉素（KAN），IPTG，丙烯酰胺（ACR），十二烷基硫酸钠（SDS），三羟甲氨基甲烷（TRIS）等：质粒提取试剂盒，凝胶回收试剂盒购自购OMEAG自北京索莱宝科技有限公司，限制酶，T4连接酶购自Thermo，其他药物供国内使用。物的合成和测序由Platinum Biotechnology（Shanghai）Co.，Ltd。行。法黄芪提取菌丝体RNA及合成cDNA新鲜菌丝体A.将Angustifolia在液体培养基中培养14天，然后根据TRIZOL方法从RNA中提取。测试纯度和浓度后，使用逆转录试剂盒。成cDNA并每20μl系统含有500ng RNA样品，并将产物储存在-20℃直至使用。增和克隆的序列的恢复，并在下载的NCBI（GenBank登录号：KT070558）被设计用引物F-PE-CG-GGATCCATGTGGTCAACTAACTACG和-PE-R：CCCA-AGCTTTCACCACCGAGACTCT，上游和下游的BamHI限制位点，并将HindIII和相应的保护碱基的PCR扩增条件在95℃下prédénaturés3分钟，32个循环在94℃变性30秒，623℃，40秒，72℃，100秒。后延长至72°C，持续7分钟。PCR产物通过电泳回收，克隆到pMDTM18-T载体中，转化到感受态大肠杆菌DH5α细胞中，并筛选阳性克隆后进一步扩大，萃取质粒送去测序。
组质粒的pET28a-SE的pMD18一本身的结构和适当的顺序的pET28a质粒用BamHI和HindIII，切两次respectively.The酶促反应系统是30微升：含有快速消化缓冲液3微升10×20 μLpMD18-se或pET28a。粒，BamHI消化，HindIII位，每次15微升，ddH 2 O中的4微升的，反应条件为37℃20分钟，灭活在80℃下10分钟。过电泳回收消化的产物，然后用T4连接酶连接。连接的产物转化到大肠杆菌BL21感受态细胞（DE3）中并筛选阳性转化体。一步扩增后，提取质粒并通过酶消化进行验证。持细菌溶液使用。选诱导融合蛋白的pET28a-SE的唯一因素是用来分析影响由蛋白质诱导表达的三个因素，并进行单因素试验和正交试验，分别。达和纯化诱导蛋白的方法是根据林余雄杰等人的方法进行。别10上清液并且将沉淀的样品的微升进行SDS-PAGE，结果表明目标蛋白质位于上清液中。IPTG对靶蛋白的表达的浓度的效果：IPTG的在培养基中的最终浓度设定为01，02，04，06，08毫摩尔/ L，培养在15℃下进行200h的/ min持续5小时。集细胞并用超声处理。碎后，进行SDS-PAGE电泳，IPTG试验组不用作对照（CK）。靶蛋白的表达的诱导作用培养时间：IPTG的在培养基中的最终浓度为06毫摩尔/ L，在培养温度为15℃，将培养物在摇动200转/分钟，分别为3，5，7，9，11小时。旦SDS-PAGE电泳检测到。
目标蛋白质的表达的诱导培养温度的影响：IPTG的在培养基中的最终浓度为06毫摩尔/升和培养温度分别为15，18，21，24在27℃下以200rpm培养5小时。旦SDS-PAGE电泳检测到。交试验L9（34）对靶蛋白的诱导和纯化根据单因素试验，正交试验L9（34）（表1）的结果，设计用于通过诱导表达和纯化提取蛋白质，提取总蛋白质和纯化的蛋白质用于SDS。- PAGE电泳（5％浓缩凝胶，12％分离凝胶），观察试验结果。数据使用EXPASY数据库预测分子量和等电点进行处理，然后将SDS-PAGE电泳的结果与软件专业凝胶分析分析SPSS 200用于正交设计。果和讨论的表达载体pET-28a中-SE的构建和验证通过使用樟的cDNA的所述樟菌丝的产物的片段的PCR扩增由通过琼脂糖凝胶电泳检测1％以获得对应于片段的预期大小的单个带。化条带（1446bp）并克隆到载体pMD18-T中。
性克隆被选择和质粒消化extrait.Après用BamHI和Hind III用相同载体pET28a双断开连接并转移到大肠杆菌。DH5α中后获得阳性克隆，并进行萃取，并通过双酶切用BamHI验证质粒和HindIII结果表明，相同大小频带作为目标片段（图1）表明，pET28a中硒载体具有已成功建造。蛋白的靶蛋白表达的优化条件的原核表达和纯化太低，以促进蛋白质的随后的纯化，正交图案的一个因素是用于优化表达的条件原核表达。组质粒pET28a中验证就是，转化大肠杆菌BL21（DE3）中并用不同的诱导时间，诱导温度和IPTG的浓度最佳化。果表明，与在IPTG终浓度逐步增加，靶蛋白的表达也增加progressivement.Lorsque浓度为01和06毫摩尔/ L之间，表达的水平相当于（图2-a），IPTG的表达由单一因子诱导。蛋白质纯化至约50ku的大小（图2-b）。诱导时间为3至5时，靶蛋白的表达逐渐增加，但是当诱导时间为7小时以上，表达水平开始下降（图图3 ）：当温度为15和27℃之间，在第一增加目标蛋白质的表达，然后随着温度的升高而减小，然后当表达式达到或超过26℃（图4减小）。）。化，并通过正交试验IPTG的终浓度，诱导时间和感应温度的靶蛋白的纯化通过正交设计L34优化。过His60Ni纯化诱导的蛋白质，然后进行SDS-PAGE。Pro Analysis预测蛋白质浓度（图5-a，图5-b，表2）。
的处理因素效应曲线的正交试验和分析的个体间效应SPSS 20表明，当IPTG的终浓度为02毫摩尔/ L。诱导时间为下午7点与起始温度为26℃下的表达水平是最佳的和模型显示出显著差（R2 = 0986，调整R2 = 0943，P <005）（表3，图6 ），在SE蛋白的表达诱导和主要和次要因素是：时间>温度> IPTG的终浓度，并且时间对靶蛋白的表达（P <005一个显著效果），最终的IPTG浓度和温度对于目标蛋白的表达不显着。（P> 005）。论和结论A中果实和菌丝体中重要的活性物质。
华鳖具有显着的药用价值和经济效益，如氧化[14]和预防细胞凋亡[15]。SE是在合成途径中三萜类化合物[10]的最大限制酶之一，并从中国草药如人参被克隆，[16]的刺五加刺五加[17]和Gynostemma pentaphyllum [18]。才Li及其同事发现有表达水平到刺五加[19]的内容和皂苷叶片之间的显著正相关;士璀江和他的同事还研究了皂素14个机构，包括根，侧根，茎，叶和西洋参的叶柄的内容。鲨烯合酶（sqs）基因与se正相关[20]。伟及其同事发现，人参中的原核表达和活性表明它与人参皂苷的合成密切相关。此，净化系统和制备重组蛋白的SE敷设在菌丝体三萜类化合物和樟芝的子实体的合成的研究的基础。究蛋白质功能的主要途径是原核重组，而大肠杆菌是最强大的重组蛋白表达系统之一[21]。核表达载体pET28a共同绑定到T7噬菌体的转录系统与mRNA合成率比大肠杆菌的高5倍，使靶基因的有效表达。此同时，载体还包含在N末端和C组氨酸标签（His-标签），其可以特异性结合于金属离子，例如镍，在不影响重组蛋白的结构或功能，并提高了目标蛋白纯化的效率。为常用载体之一[21]，载体用于A的原核表达。Sinensis，高效，快速，准确。
应条件通常是影响biologiques.Les研究者反应中的反应的反应的主要因素经常需要找到最佳的反应条件和影响以不同的方式反应的主要和次要因素。因素试验和正交设计被用来研究原核表达的影响上表达的效率（IPTG的终浓度诱导剂，诱导时间，诱导温度）自我。最重要的好处[22]，通过破坏获得的蛋白质和蛋白质的上清液常规电泳观察结果，以及分析软件分析临凝胶电泳结果的SDS-PAGE电泳BL21 Ecoil细胞可以为研究SE的物理化学性质和酶活性奠定基础。项研究的结果表明，五味子的最佳诱导的条件为：IPTG的终浓度为02毫摩尔/ L时，诱导时间为下午7点和感应温度为诱导的主要和次要因素是IPTG的时间，温度和最终浓度。白质样品的收集至关重要，为有效的自我表达和随后的功能验证奠定了基础。[HS22]参考文献：[ZK（＃]赵云生，万得光陈新等人。五环三萜皂苷[J]。国草药，2009年（2）生物合成的进展和监管：327-330Jandrositz一个Turnowsky F，G Hgenauer酿酒酵母的基因编码角鲨烯环氧：克隆和表征[J]基因，1991，107（1）：155-160。3]尾河男，Kinohira S，安藤A，等人。微藻莱茵衣藻由角鲨烯合成酶的基因的遗传修饰，和角鲨烯环氧角鲨烯的积累[J]公共科学图书馆一，2015.10（3）：E [4] SPANOVA男，Daum的ģ角鲨烯 - 生物化学，分子生物学，生物技术方法，和生物技术[J]的经济研究的，2003，21（4）[6]汉JY，在JG，权YS等人。过在人参[J]植物化学，2010年，角鲨烯环氧酶基因的RNA干扰调节的人参皂甙和植物甾醇的生物合成，71（1）：36-46 [7]滹围。宁田吁铧等鲨鱼人参克隆和烯烃环氧酶基因的原核表达[J]西北大学学报AF（自然科学版），2012.40（10）：207-212 [8]常T，上樟属十一月kanehiraiW¯¯周牛樟芝在台湾[J]真菌研究，1995年，99（6）：756-758 [9]路MC，埃尔 - Shazly，TY Wu等人，研究。
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