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在这项研究中，17 046的Uni-IS经测序的cDNA片牛蒡，并从这些检测到的1316个SSR位点获得，平均1个SSR位点的25.7 kb的IS。能注释显示1，242个SSR-EST中有690个可分为三个功能类别和18个功能子类别。蒡EST-SSR二核苷酸重复类型具有最高频率，其次是第三核苷酸。184个重复单位（32.4％）中AG / CT的频率最高，其次是AAG / TTC（9.3％）。537对SSR引物从SSR-1242设计和IS150对随机选择用于香椿，巨桉和S检测牛蒡和转印的多态性。结果显示有44对引物特异性扩增牛蒡，其中17为多态性和等位基因检测的数目为2至7，平均为3.02。农，深水和水蚤中酿酒酵母SSR标记的可转移率分别为97.7％，97.7％和95.3％。类分析表明，14属可分为5类，遗传相似系数为0.76，聚类结果与植物分类结果基本一致。键词牛蒡; EST-SSR;标记发展;遗传多态性分类号Q949.747.5文档代码AAbstract 17046 EAST英国通过测序的cDNA樟kanehirae其1316个SSR位点进行鉴定SSR 1上各为25.7 kb的生成。GO（本体）的分析表明，690 SSR-EST可以分成三个功能类别和子类别18的功能，二核苷酸重复是最丰富的重复类型中，接着在184模式类型，AG / CT（32.4％）是最丰富的，其次是AAG / TTC（9.3％）。
于1242 SSR-EST，共537个引物对150检测在樟树C. kanehirae测试和转印多态性，C。C.山白parthenoxylon.Les结果表明44对引物C. kanehirae，其中17对是多态性和等位基因检测的数目为2至7，平均的3.02的特异性扩增。SSR标记kanehirae C.在樟树的传送速率，C。C.山白parthenoxylon分别为97.7％，分别为97.7％和95.3％。组的结果与分类关键词botanique.Mots樟kanehirae EST-SSR标记开发的结果是一致的，多态性génétiqueDOI10.3969 / j.issn.1000-樟kanehirae干草，也被称为野鸡黑色，属于lauraceae属的樟属，是来自台湾的本地物种，被列入国家保护植物名单。蒡不仅是木雕，家具和建筑的原料，也是具有高观赏价值的景观树。个牛蒡植物含有芳香油，其主要成分是黄樟，是茉莉醛的原料，在工业上有很多用途。外，牛蒡是樟芝的寄生树种。芝芝在医学上被称为“医学之王”。具有增强免疫力，抗癌，抗过敏，减少血脂，排毒和保护肝脏的药用和保健作用[1 ]。年来，重要森林的遗传多样性和遗传选择显着增加[2-3]。而，缺乏有效的DNA标记，对牛蒡的收集，分类，遗传多样性和遗传选择的持续研究仍然非常缓慢。此，开发有效的DNA标记已成为牛蒡遗传资源开发利用的重中之重。年来，通过第二代DNA测序技术获得的EST数据（表达序列标签）已成为SSR（简单序列重复）的重要来源[4]。对于SSR基因组，EST-SSR具有特别的优势：（1）大量信息，EST-SSR是表达基因的一部分;当基因控制特性时，标记与该特征结合[5]; （2）高转移性，转录区的EST-SSR序列比非转录区更保守;因此，它在相关物种中具有较高的可转移性，可用作比较基因组研究。共品牌[6]; （3）开发简单，快速，廉价。EST-SSR品牌的开发通常是转录组数据分析的“副产品”，几乎不需要任何费用。前，大量的EST-SSR标记[7-11]在经济林如橡胶，胡杨，云杉，牡丹和茶树被开发，并应用于多样性分析遗传学，遗传作图，基因定位和QTL分析。-14]，但尚未在小腿上开发EST-SSR标记。于所述的EST序列数据表牛蒡通过测序获得，所述EST-SSR标记牛蒡通过分析牛蒡EST-SSR和它们的多态性和的频率分布和特征开发布尔多克的其他芸苔属植物。估可携带性为开发和使用以下牛蒡遗传资源奠定基础。料和方法材料实验材料EST 2.4通过测序牛叶cDNA文库获得的Gb序列数据。
牛蒡至IS-SSR检测，4樟树，沉水樟1和樟由福建亚热带植物研究所（表1）提供的8个样品。剂和仪器植物DNA提取试剂盒于磁珠（目录AU3111，生物技术，中国）。iSeq测序系统2500（Illumina公司，USA），超微型分光光度计（型号：使用Nanodrop 2000的Thermo Scientific，德国），Fragment自动毛细管电泳系统AnalyzerTM（型号：FSV2-CE，制造商：AATI，USA）。法牛蒡叶的RNA提取和EST测序从牛蒡样品C. kanehirae-1中选择幼叶作为测序材料，在液氮中冷冻，置于冰箱中在80°C下冷冻保存。后，总RNA，牛蒡和真核mRNA的叶子用寡聚（dT）和断裂缓冲磁珠富集提取物用于分级分离的mRNA成短的片段，用作矩阵和随机六聚体（六个碱基随机）。物）合成的第一cDNA链，然后的质量的测试后添加缓冲液，dNTPs，香樟树RNA酶H和DNA聚合酶I.为了合成第二链cDNA，该库被构建基因。Hiseq 2500测序系统上进行100对成对碱基对的测序，进行RNA提取，逆转录，数据库构建，测序和序列剪接过程。京诺和致远生物信息有限公司为辅芸苔属DNA的提取使用磁性球植物的DNA提取试剂盒提取芸苔属植物的基因组DNA，并通过电泳检测DNA的质量。1％琼脂糖凝胶上，使用超微分光光度计测量DNA浓度。超纯水将所有DNA样品均匀稀释至50ng /μL，并在20℃下储存直至使用。SSR位点搜寻牛蒡的原始EST序列中的Uni-IS被合并和被搜查使用MISA软件（微卫星鉴定工具）（HTTP SSR位：//pgrc.ipk -gatersleben.de/misa/）。索标准分别是核苷酸基序基序≥10，7，5，4和4的两次，三次，四次，五次和六次重复次数。于很难区分EST-SSR中单个核苷酸的A / T重复与cDNA中的PolyA / T，本研究不包括搜索范围内的单个核苷酸重复。据搜索条件，参数MISA配置文件（misa.ini）从表示的长度的第一数量设置为2-10，3-7，4-5，5-4，6-4，数据SSR模式，两个数字代表模式的最小重复次数。SSR引物设计使用Primer Premier 5软件（http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/）从SSR基因座的侧翼序列设计引物。物设计标准：（1）引物长度18~24 bp; （2）GC含量在40％至60％的引物中; （3）扩增产物大小预期为100~500 bp; （4）引物（Tm）为72℃的最佳溶解温度，最佳温度为55℃。CR扩增和PCR扩增系统的检测20微升是：50ng的基因组DNA， 0.15摩尔/ L，0.2毫摩尔/ L，1U的Taq DNA聚合酶的dNTP，PCR 1×缓冲液（50毫摩尔/ L）的KCl，1.5毫摩尔/ L的MgCl 2，0的正的和负的引物1％明胶，10mmol / L Tris-HCl，pH8.3）。PCR程序：94℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃5分钟。用自动片段分析仪TM毛细管电泳系统通过电泳检测扩增产物。SSR-EST的功能说明为了研究Burdock SSR-EST基因的功能，Blastx工具在本研究中使用> 35％。ORF SSR EAST使用查找开放阅读框（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）找到在SSR-EST的开放阅读框（SSO）的预测预测5-UTR（非翻译区5），CDS（编码序列）或3-UTR（非翻译区3）中的SSR基因座。过在试验材料的IS-SSR引物检测等位基因的数目汇集和分析，电泳峰在电泳迁移和峰的相同的位置为等于0。类分析记录为一个使用NTSYSpc软件进行（HTTP：// /www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html），聚类法是使用算术平均的未加权对群方法（UPGMA）。
果和分析牛蒡中的EST-SSR分布是通过剪接牛血清cDNA文库测序获得的原始序列获得的，获得了17046个Uni-ESTs。共1316个SSR位点都是由MISA软件检测，分为1 242是在的1 SSR / 25.7 kb的一个频率，包含70多于一个的SSR。二，第三，第四，第五和第五个六核苷酸重复序列存在于牛蒡EST-SSR中，并且发生的频率显着不同。观的最高频率是二核苷酸重复（44.1％）（581），接着三核苷酸（23.6％（310）），四，五个六核苷酸（分别为9.1％和13.5％）。％和9.6％（表2）。这项研究中，IS-SSR的平均长度为21个碱基，和第二的重复长度，第三，第四，第五和第六个核苷酸分别为20.4，21.5，20.6，20 ，6和25.7 bp（表3）。dicho核苷酸单元EST-SSR的出现频率下降与越来越多的重复：有469个例如二核苷酸基序的重复10次，只有105复制11倍。中只有7个重复了12次。这项研究中，IS-SSR牛蒡物种是丰富的，并且包含184种类型的图案，并五点五十八核苷酸的重复分别含有3，10，21，56和94类型的图案。图1可以看出，具有最高出现频率图案的类型是AG / CT（32.4％），其次为AAG / CTT（9.3％），三是AT / AT （8.9％）。SSR-EST的功能说明由于SSR-EST是表达基因的一部分，EST-SSR优于基因组SSR的最大好处是其生物学功能。这项研究中，1242 SSR-IS牛蒡进行检测，其中690 SSR-的EST在三个功能类别和18级的功能的子类注释，并且剩余的552个SSR-IS缺乏相似的基因序列数据库。有功能评论（表4）。及与“生物过程”相关联的SSR 232 EAST 11级功能的子类的功能，34.5％，用细胞过程有关，17.8％，用代谢过程和11.6％的相关联的相关联的细胞发育。与功能258 SSR-IS的11种分子功能的，与结合因子相关联的EST的数目最高（31.8％），其次是催化反应（27.5％）。与细胞组分相关的200个SSR-EST中涉及的六种功能中，54.5％是细胞连接的，20.5％是细胞质的，其余是25％。1，242个SSR-EST牛蒡引物上进行EST-SSR多态性分析，由于SSR侧翼序列的长度，其中705个未被设计。后，仅成功设计了537对SSR引物。了检测引物的扩增效果，随机选择150对引物以扩增来自不同区域的8个牛蒡样品样品（表1）。果表明，有44个引物对能够扩增牛蒡中的特异性条带，只有43对扩增的非特异性条带，其余63对不含扩增产物。特异性扩增引物中，38对扩增长度与预期完全一致，另一对大于预期，5对小于预期。43对扩增引物特异于牛蒡也可产生香农，神水和大叶蝉的有效扩增分别为97.7％扩增率，97.7％和95.3％，与平均幅度为96.9。％，表明牛蒡EST-SSR在该属的其他三个物种中具有高转移性。41对特异性扩增引物能够检测8个牛蒡样品中的多态性。于每对引物检测到2至6个等位基因（图2），平均为3.02（表5），并且检测到总共134个等位基因。44对突发特异性EST-SSR引物能够检测到14种芸苔属植物的多态性。每个引物对检测到的等位基因的数目为2至8，平均4.3，和等位基因的总数为189的等位基因通过扩增引物检测的平均数目5-UTR，CDS和小牛的3-UTR的SSR分别为3.57，2.56和2.67（表5）。然，在Burdock EST中，5-UTR和3-UTR的SSR具有比CDS更高的多态性。栎属的聚类分析表明，栎属物种样品之间的遗传距离范围为0.89至0.74（图3）。0.76的相似系数，14倍桉属植物的样品可被分成五大类，第一类包括牛蒡的八个样本，样本之间的遗传距离是从0.89至0.765;第二类包含柠檬（C. Camphora-2）和C. parthenoxylon的样品;第3类仅包含C. micranthum;第4类仅含有一种肉桂样品（C. camphora-1）;第5类包含2个樟脑样本（C. camphora-3和C. camphora-4）。论在本研究中，17 046 EAST英国通过测序转录和1316 SSR位点获得的被寻找，总共1242 EST（7.2％）含SSR，的指示SSR在东牛蒡很丰富，但与其他树林。朝鲜蓟（13.9％）[15]中，橡胶（23.9％）[16]和花蕾（7.7％）相比，[4]中，EST-SSR含量是由于仍然低木本植物的多样性。索标准EST-SSR是不同的。这项研究中使用的数据是更严格的，第一无单核苷酸重复，接着是第二，第三，第四，第五和六核苷酸重复至少10，7，5，分别为4和4。高于其他研究的标准。EST-SSR植物主要由三核苷酸和二核苷酸重复[17]，包括三核苷酸重复的是被子植物更常见，但一些木本植物主要是二核苷酸重复，如羊。木，茶树，山椒等[18-20]。这项研究中，二核苷酸重复EST-SSR标记为44.1％，这比三核苷酸重复（23.6％），其类似于与其它木本植物这样获得的结果的显著更高比白杨树和茶树。类型的重复EST-SSR标记的单元的主要是以下：AG / CT（32.4％），AT / AT（8.9％）和AAG / CTT（9.3％），类似于橡胶[16]和Caragana korshinskii [21]。也是被子植物中最丰富的重复类型。述150双在本研究中使用EST-SSR标记的引物具有63对产品无扩增和其它43对产生的非特异扩增，和失败的放大的比例较高，这可能是因为（1）牛蒡基因组的复杂性，一些Uni-EST序列无法正确拼接; （2）上游和下游起始位点之间存在一个或多个长链内含子; （3）放大段中存在更复杂的高层结构。对44对可扩增引物比预期的长，这可能与在扩增产物中包含内含子或插入小DNA片段有关。论上，由于EST受选择压力的影响，序列比基因组的其他区域更保守。此，EST-SSR在相关物种之间具有比基因组-SSR更高的可转移性。前，对植物TSEs-SSR的可转移性的研究支持这一观点[6]。研究表明，牛蒡中的EST-SSR在其他芸苔属植物中具有较高的可转移性。类分析表明，EST-SSR簇的结果通常与植物学分类的结果是一致的：例如，八个样本牛蒡进行分组，并且可以是从其他类型完全区别开。
而，由于缺乏形态性状和DNA标记之间显著的相关性，根据形态特征和EST-SSR分类结果的植物学分类不完全一致。外，由于EST-SSR对其他桉树植物牛蒡的特异性降低，聚类结果可能有偏差。如，IS-SSR牛蒡-SSR樟将不属于在样品樟树-2相同的物种（物种）和C. parthenoxylon的。EST-SSR具有信息量大，通用性好，开发成本低，成本低等优点，但也存在明显的缺点，即多态性低。究表明SSR基因座多态性与核苷酸重复序列数呈正相关。复次数越多，多态性越高[22]。
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